Confocale, TIRF, FLIM, biphotonique… Ces différentes techniques de microscopie permettent aux scientifiques d’observer le monde cellulaire. Leur point commun ? Elles utilisent les propriétés fluorescentes des molécules. Excursion en images dans l’univers du très petit.
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Voyage au cœur des cellules
« La microscopie à fluorescence est très sensible et permet la détection de plusieurs molécules simultanément » explique Laurence Dubreil, responsable de la composante bio-imagerie de la plateforme APEX (UMR703, INRA Oniris) « Ce phénomène est possible grâce aux fluorochromes, des molécules capables d’absorber de la lumière puis de restituer immédiatement cette énergie sous forme d’une lumière à la longueur d’onde plus grande ». Les fluorochromes peuvent être chimiques mais également naturels. On en trouve par exemple dans les racines de muguet (Convollaria majalis) dont la coupe transversale représentée ici sert de référence pour régler des microscopes à fluorescence. © MicroPICell, Inserm UMS016
En microscopie confocale, on utilise un laser comme source de lumière. Il est absorbé par les fluorochromes qui vont alors « permettre de distinguer un compartiment précis de la cellule ou un type cellulaire : la membrane, le noyau, les lymphocytes, etc. » Sur cette coupe transversale de muscle de souris, en vert la membrane des fibres musculaires, en bleu les noyaux des cellules et en rouge des noyaux particuliers que l’on distingue par un marquage spécifique. © Laurence Dubreil plateforme APEX UMR703 PAnTher INRA Oniris
« Cette image est la reconstruction de 2 900 images confocales » indique Philippe Hulin, ingénieur enbio-imagerie de la plateforme MicroPICell (INSERM, CNRS, Université de Nantes). On voit ici le réseau neuronal d’une rétine de chien. © Tshilenge TK, Inserm U1089
Cette cellule humaine embryonnaire a été prise, à gauche, par un microscope confocale classique et à droite par un microscope à lumière structurée (SIM). « Il s’agit du seul microscope de ce type dans le grand ouest. Il possède une résolution optique telle qu’elle nous permet de quitter la microscopie pour entrer dans la nanoscopie. » © L. Boutin; S.Nedellec.
Les chercheurs utilisent aussi la microscopie FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) pour mesurer le temps qu’une molécule peut passer à l’état excité, c’est-à-dire lumineux. « Quand une molécule émet de la lumière moins longtemps que prévu, comme ici en bleu, c’est qu’il y a une perte d’énergie et donc une interaction avec une autre molécule. » Ces interactions sont analysées chez des patients atteints de la mucoviscidose par exemple. © MicroPICell, Inserm UMS016
Certains tissus sont très autofluorescents et émettent une fluorescence proche de celle des fluorochromes utilisés en recherche, comme la Green Fluorescent Protein (GFP). « Dans ce cas on utilise la microscopie confocale spectrale, explique Laurence Dubreil. Cette technique très sensible permet de différencier deux signaux fluorescents très proches. » Sur cette coupe transversale de moelle épinière la fluorescence spécifique de la GFP apparaît en vert et l’autofluorescence du tissu en violet. © Laurence Dubreil plateforme APEX UMR703 PAnTher INRA Oniris
Cette représentation 3D d’un réseau de neurones est issue d’un microscope biphotonique. Cette technique ressemble à celle de la microscopie confocale, à la grande différence que le laser utilisé n’émet pas dans le spectre du visible mais dans celui de l’infrarouge : plus pénétrant dans les tissus, moins énergétique et donc moins phototoxique. « La biphotonique est ainsi plus indiquée pour observer les échantillons épais et les tissus vivants. » © APEXLaurence Dubreil plateforme APEX UMR703 PAnTher INRA Oniris
Pour mieux comprendre les processus cellulaires au niveau de la membrane, les chercheurs utilisent la microscopie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). « Elle permet de voir les molécules fluorescentes localisées à l’interface cellule/verre, c’est-à-dire au niveau des 100 premiers nanomètres des échantillons. » A gauche une image TIRF, à droite la superposition avec une image prise au microscope conventionnel. © Laurence Dubreil plateforme APEX UMR703 PAnTher INRA Oniris
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